Bradford Protein Quantification Kit

Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

目前，最cang用的蛋白濃度檢測(cè)方法是：BCA蛋白定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）和Bradford蛋白定量試劑盒（Bradford Protein Assay Kit）。與蛋白濃度測(cè)定的其他方法（比如：BCA法和Lowry法）相比，Bradford法更簡單、更穩(wěn)定、兼容性更好。Bradford法測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學(xué)物質(zhì)的影響，尤其是還原劑的影響。樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達(dá)1M，DTT的濃度可高達(dá)5mM，但本法受高濃度去垢劑的影響明顯，需確保SDS低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20、60、80低于0.015%。含高濃度去污劑的蛋白定量，建議采用BCA蛋白定量試劑盒（MP1902-500T）。

本Bradford蛋白定量試劑盒（Bradford Protein Assay Kit）的檢測(cè)原理是：在酸性乙醇溶液中，考馬斯亮藍(lán)G250（Coommassie Brilliant Blue G250）與蛋白結(jié)合顏色由棕色變?yōu)樗{(lán)色，溶液的吸收峰從465nm遷移到595nm，顏色的變化與蛋白濃度成正比，因此，可通過檢測(cè)595nm處的吸光度對(duì)溶液中蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。本試劑盒檢測(cè)速度很快，少量樣品一般只需10min即可完成檢測(cè)，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25μg/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5μg，待測(cè)樣品體積為1～20μl，在50~1000 μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

產(chǎn)品組分

保存與運(yùn)輸方法

保存：室溫保存，1年有效。蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制成溶液后應(yīng)置于-20℃保存。

運(yùn)輸：室溫運(yùn)輸。

自備材料

1. 酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)、96孔板或比色杯、離心機(jī)、離心管

2. 蒸餾水、0.9% NaCl或PBS

使用方法

1. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備

1.1 取1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到20mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)BSA中，充分溶解后配制成20mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃長期保存。

1.2 取適量20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0.5mg/ml或所需濃度。例如取25μl 20mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入975μl稀釋液，充分混勻，即可配制成0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)?！咎貏e提示】：待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中。但為了簡便起見，一般也可以用0.9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以-20℃長期保存。

2. 蛋白濃度的測(cè)定

2.1 將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板或EP管中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足至20μl，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。

2.2 加適當(dāng)體積樣品到96孔板或EP管中。如果樣品不足20μl，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μl，需注意記錄樣品體積。

2.3 各孔加入200μlG250染色液，室溫放置3~5min。

2.4 酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測(cè)定595nm波長處的吸光度（OD值），如無595nm，560～610nm波長范圍的吸光度也可。

2.5 根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用樣品體積計(jì)算樣品的蛋白濃度。

注意事項(xiàng)

1） G250染色液回復(fù)至室溫充分混勻后使用，有利于提高檢測(cè)的靈敏度，加完G250染色液后，盡量在30min內(nèi)完成吸光度的測(cè)定，防止沉淀形成后影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2） 蛋白標(biāo)準(zhǔn)在全部溶解后先混勻，再稀釋成一系列不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)。

3） 待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否則待測(cè)蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測(cè)定不準(zhǔn)確。

4） 建議每次測(cè)定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。因?yàn)闇y(cè)定時(shí)顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長不斷加深，并且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時(shí)間和溫度，否則如需精確測(cè)定宜每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5） 如果沒有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色杯的最小檢測(cè)體積。應(yīng)按比例適當(dāng)加大G250染色液、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量使總體積不小于最小檢測(cè)體積，使用分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度時(shí)，每個(gè)試劑盒可以測(cè)定的樣品數(shù)量可能會(huì)顯著減少。

6） 用比色杯測(cè)定蛋白含量時(shí)，由于考馬斯亮藍(lán)易結(jié)合石英比色杯，應(yīng)優(yōu)先選用一次性塑料比色杯，如用玻璃比色杯，比色完畢后應(yīng)立即用乙醇清洗干凈。

7） 試劑開封后請(qǐng)盡快使用，以防影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果。

8） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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